摘要：骨-韌帶界面的構(gòu)建采用了多種策略，這對(duì)組織再生和了解界面再生機(jī)制都有重要價(jià)值。然而，如何總結(jié)天然骨-韌帶界面的復(fù)雜性和異質(zhì)性，包括結(jié)構(gòu)、細(xì)胞和力學(xué)梯度，仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。在這項(xiàng)工作中，提出了一種通過(guò)熔融靜電紡絲寫入（MEW）制作的仿生網(wǎng)格卷曲微圖案，以模擬骨-韌帶界面的天然結(jié)構(gòu)。開(kāi)發(fā)了卷曲纖維微圖案的打印策略并優(yōu)化了工藝參數(shù)，用于模擬韌帶中膠原纖維的卷曲結(jié)構(gòu)。研究了卷曲角和纖維間距對(duì)成纖維細(xì)胞取向的導(dǎo)向作用，兩者都表現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞排列效果。

研究背景：迄今為止，韌帶損傷的臨床治療和韌帶到骨連接的再生在矯形醫(yī)學(xué)中仍然具有挑戰(zhàn)性。因此，體外構(gòu)建骨-韌帶界面結(jié)構(gòu)不僅對(duì)組織移植物的開(kāi)發(fā)和受損界面的再生具有重要價(jià)值，而且有助于更好地理解結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系和界面再生的機(jī)制。

研究亮點(diǎn)：熔體靜電紡絲書寫(MEW)是一種新興的3D打印技術(shù)，通過(guò)控制打印板塊來(lái)制作具有預(yù)定幾何形狀的微纖維圖案.由于它的多功能性，已被廣泛用于制造各種組織工程應(yīng)用的結(jié)構(gòu)和支架。考慮到 MEW 的打印靈活性，MEW 打印卷曲纖維的可行性，以及新網(wǎng)格結(jié)構(gòu)在成骨方面的優(yōu)勢(shì)。本研究中用 MEW 制作了一種生物啟發(fā)的網(wǎng)格卷曲微圖案，用于模擬天然骨-韌帶界面結(jié)構(gòu)。首先，開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了一種新的基于卷曲纖維的書寫方法。

首先選擇16 kPa 的氣壓和 7mm/s 的收集器速度來(lái)印刷以下卷曲圖案。不同預(yù)設(shè)卷曲角的卷曲纖維微圖案從 0°到30°。制造的卷曲纖維具有與韌帶中的體內(nèi)天然膠原纖維相當(dāng)?shù)膮?shù) ，暗示了新模型的良好借鑒意義用于模仿韌帶結(jié)構(gòu)的卷曲纖維圖案。為了研究卷曲角對(duì)細(xì)胞取向的影響，NIH/3T3 成纖維細(xì)胞分別在卷曲角為0°,10°,20°和 30°的微圖案上培養(yǎng)，并在培養(yǎng) 2 天 后通過(guò)細(xì)胞骨架免疫染色進(jìn)行表征。（如圖1所示）表明直纖維和卷曲纖維對(duì)細(xì)胞取向和形態(tài)有明顯的導(dǎo)向作用。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞的取向角，即細(xì)胞核方向和纖維主方向之間的角度，進(jìn)一步定量評(píng)估排列。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，細(xì)胞取向角和纖維卷曲角表現(xiàn)出良好的一致性

在我們的研究中，優(yōu)化新的加工參數(shù)后，可以獲得纖維間距小至 50 μm 的改善的卷曲纖維微圖案，這將更有利于細(xì)胞排列，NIH/3T3 細(xì)胞的骨架對(duì)纖維間距為 50、100 和 200 μm 的卷曲微圖案表現(xiàn)出不同程度的排列。隨著纖維間距變大，觀察到微圖案的細(xì)胞排列效果減弱。正如所料，纖維間距為 50 μm的微圖案比間距為 100μm和 200 μm的微圖案對(duì)細(xì)胞取向顯示出最強(qiáng)的導(dǎo)向作用。采用優(yōu)化的工藝參數(shù)可以成功地制備出具有不同卷曲角(0 –30° )°和纖維間距(50–200μm)的新型卷曲纖維微圖案，這兩種微圖案對(duì)細(xì)胞取向的引導(dǎo)都有一定的影響。

將上述制備的具有不同纖維間距的網(wǎng)格微圖案用于培養(yǎng)人成骨細(xì)胞 Saos-2 細(xì)胞。圖3 (A)顯示了 7 天和 14 天后的代表性 ALP染色圖像成骨誘導(dǎo)。纖維間距為 50μ m 的新網(wǎng)格微圖案導(dǎo)致 ALP 的顯著最高表達(dá)，并且各組中 ALP 的表達(dá)隨時(shí)間增加。與對(duì)照相比，新的網(wǎng)格微圖案顯示出更大的礦化和更好的成骨活性，特別是具有 50 μm 纖維間距的圖案，這可歸因于微圖案的 3D 形貌和由此增加的細(xì)胞生長(zhǎng)比表面積。而且新型網(wǎng)格卷曲管狀支架就能夠滿足天然骨-韌帶界面組織的形態(tài)和力學(xué)要求，顯示出用于骨-韌帶界面組織工程的良好潛力

結(jié)論：MEW成功地制造了網(wǎng)格卷曲多相微模式，以模擬天然骨-韌帶界面的結(jié)構(gòu)。開(kāi)發(fā)了制造卷曲纖維微圖案的策略優(yōu)化了包括氣壓和收集器速度在內(nèi)的參數(shù)。制備了纖維間距為 50-200 μm 的網(wǎng)格微圖案，并且顯示出比對(duì)照更好的成骨活性，尤其是間距為 50 μm 的圖案。將具有不同纖維間距的網(wǎng)格卷曲微圖案用于 NIH/3T3 細(xì)胞 和Saos-2 細(xì)胞的共培養(yǎng)，細(xì)胞遷移結(jié)果表明較小的纖維間距導(dǎo)致更快的遷移速度和更早的細(xì)胞在界面區(qū)域相遇。通過(guò)卷起新的網(wǎng)格卷曲微圖案，最終生成了 3D 管狀三相支架，顯示了與天然骨-韌帶組織的結(jié)構(gòu)和力學(xué)相似性，這有望在我們未來(lái)的研究中用作體內(nèi)骨-韌帶界面再生研究的新型支架。 

本文由輕子納米團(tuán)隊(duì)在《Biofabrication》期刊上發(fā)布的最新研究。生物打印材料在未來(lái)的醫(yī)學(xué)臨床使用上具有廣闊的應(yīng)用前景。由輕子納米研發(fā)的近場(chǎng)靜電直寫設(shè)備M08-001，通過(guò)近場(chǎng)直寫靜電紡絲技術(shù)可制備高度取向的納米纖維，可實(shí)現(xiàn)溶液近場(chǎng)紡絲或熔體近場(chǎng)直寫，可打印用于血管修復(fù)、皮膚修復(fù)、生物補(bǔ)片等生物組織修復(fù)材料，應(yīng)用廣泛。擁有獨(dú)家專利技術(shù)，打印精度可達(dá)納米級(jí)，是一款微納米制造利器。

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